Hhip Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403293-ACT

HHIP umano codifica la proteina interagente con Hedgehog (Hhip), una glicoproteina associata alla membrana che si lega ai ligandi Hedgehog e attenua la segnalazione della via riducendo la disponibilità del ligando per PTCH1/SMO. Agendo da regolatore negativo dell’attività di Hedgehog, HHIP contribuisce a modulare i programmi di patterning dello sviluppo e l’omeostasi dei tessuti adulti, influenzando processi quali la differenziazione epiteliale, la segnalazione stroma‑epitelio e la proliferazione cellulare. Un’espressione disregolata di HHIP o un’alterazione dell’equilibrio della via Hedgehog è stata collegata a fenotipi rilevanti per la malattia in oncologia e nella biologia delle patologie polmonari croniche, inclusi effetti sul rimodellamento delle vie aeree e sulle reti di segnalazione associate al tumore. In quanto modulatore di via, HHIP è frequentemente studiato in contesti in cui i programmi trascrizionali guidati da Hedgehog intersecano la segnalazione WNT, TGF‑β e quella infiammatoria.

Hhip Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HHIP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Hhip Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HHIP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HHIP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Hhip. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HHIP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Hhip nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Hhip nelle cellule tumorali con espressione di HHIP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.