HEXIM1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402333-ACT

HEXIM1 umano (hexamethylene bis-acetamide inducible 1) codifica una proteina regolatrice nucleare che frena l’allungamento trascrizionale sequestrando P-TEFb (CDK9–Ciclina T) all’interno del complesso 7SK snRNP, limitando così la fosforilazione del CTD della RNA polimerasi II e il rilascio dalla pausa. Attraverso questo controllo dell’allungamento dipendente da CDK9, HEXIM1 influenza i programmi di espressione genica responsivi agli stimoli, la progressione del ciclo cellulare e le reti trascrizionali associate alla differenziazione. Un’alterata espressione di HEXIM1 o la perturbazione dell’omeostasi 7SK/P-TEFb è stata collegata alla disregolazione trascrizionale osservata in contesti di proliferazione e di adattamento allo stress, rendendo HEXIM1 un nodo utile per studiare i meccanismi che collegano gli input di segnalazione all’output trascrizionale su scala genomica. L’analisi della funzione di HEXIM1 supporta la ricerca sul controllo della trascrizione, sulla regolazione associata alla cromatina e su vie rilevanti per la malattia guidate da dinamiche di allungamento aberranti.

HEXIM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HEXIM1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HEXIM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HEXIM1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HEXIM1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HEXIM1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HEXIM1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HEXIM1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HEXIM1 nelle cellule tumorali con espressione di HEXIM1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.