hDcp1a Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402543-ACT

DCP1A codifica hDcp1a, un componente fondamentale dei corpi di processamento citoplasmatici (P-bodies), che fungono da impalcatura per la rimozione del cappuccio (decapping) dell’mRNA e la sua degradazione 5′→3′. hDcp1a coopera con l’enzima di decapping DCP2 e con attivatori del decapping per coordinare il turnover dell’mRNA, la repressione della traduzione e il controllo di qualità dell’RNA, collegando le risposte allo stress a cambiamenti dinamici nell’espressione genica. Attraverso la regolazione della stabilità dei trascritti, DCP1A influenza vie quali la degradazione dell’mRNA mediata da codoni di stop prematuri (nonsense-mediated mRNA decay), il silenziamento mediato da microRNA e il crosstalk tra stress granules e P-bodies. Alterazioni della degradazione dell’mRNA e della biologia dei P-bodies sono state associate a cambiamenti della proteostasi e a programmi di segnalazione aberranti osservati in contesti di ricerca su cancro e malattie neurodegenerative.

Dcp1a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DCP1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dcp1a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DCP1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DCP1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dcp1a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DCP1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dcp1a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dcp1a nelle cellule tumorali con espressione di DCP1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.