GS1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405996-ACT

La PUDP umana (pseudouridina 5′-fosfatasi), nota anche come GS1, è un enzima citosolico della rete di recupero delle pirimidine che defosforila la pseudouridina 5′-monofosfato in pseudouridina, favorendo il turnover e il riciclo dei nucleosidi modificati derivati dal catabolismo dell’RNA. Regolando i livelli dei nucleotidi della pseudouridina, PUDP influenza l’omeostasi dei nucleotidi e si interseca con vie che governano la dinamica delle modificazioni dell’RNA, il metabolismo dei ribonucleotidi e le risposte cellulari allo stress metabolico. Una gestione alterata dei nucleosidi modificati è sempre più associata al turnover dell’RNA deregolato e alla riprogrammazione metabolica osservati in diversi contesti patologici, rendendo PUDP un nodo utile per studi meccanicistici. La modulazione dell’espressione di PUDP/GS1 consente di analizzare come il metabolismo della pseudouridina influenzi i programmi di espressione genica e la fisiologia cellulare.

GS1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PUDP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GS1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PUDP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PUDP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GS1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PUDP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GS1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GS1 nelle cellule tumorali con espressione di PUDP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.