GRHL2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-434250-ACT

Grhl2 codifica il fattore di trascrizione murino GRHL2, un regolatore di tipo Grainyhead della differenziazione epiteliale, della polarità apico–basale e della formazione della barriera. GRHL2 coordina programmi genici coinvolti nell’assemblaggio delle giunzioni aderenti, nell’integrità delle tight junctions e nello sviluppo degli epiteli stratificati, collegando l’adesione cellula–cellula con la proliferazione e la morfogenesi tissutale. In diversi sistemi modello, un’attività alterata di GRHL2 è stata associata a transizioni dis-regolate dello stato epiteliale, inclusi processi legati alla plasticità epitelio-mesenchimale, alla riparazione delle ferite e all’organogenesi. Queste funzioni rendono Grhl2 un nodo utile per lo studio della specificazione delle linee epiteliali e delle vie che influenzano l’omeostasi dell’epitelio e il rimodellamento associato a malattia.

GRHL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Grhl2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GRHL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Grhl2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Grhl2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GRHL2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Grhl2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GRHL2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GRHL2 nelle cellule tumorali con espressione di Grhl2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.