GPAA1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411203-ACT

GPAA1 (glycosylphosphatidylinositol anchor attachment 1) codifica una subunità centrale del complesso della transamidasi GPI nel reticolo endoplasmatico, che catalizza l’attacco di ancore di glicosilfosfatidilinositolo (GPI) alle proteine di nuova sintesi. Questo passaggio di processamento consente il corretto ancoraggio alla membrana e il traffico di molte proteine di superficie cellulare coinvolte in segnalazione, adesione e modulazione immunitaria, collegando GPAA1 al controllo di qualità delle proteine nel RE e all’omeostasi della via secretoria. Alterazioni nella biogenesi delle ancore GPI possono compromettere la composizione del proteoma di superficie e le vie a valle, come la segnalazione mediata da recettori e le interazioni cellula–cellula. GPAA1 e i geni correlati della via delle ancore GPI sono studiati nel contesto dei disordini congeniti della glicosilazione, dei fenotipi del neurosviluppo e delle risposte allo stress cellulare associate a un processamento del RE compromesso.

GPAA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPAA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPAA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPAA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPAA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPAA1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPAA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPAA1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPAA1 nelle cellule tumorali con espressione di GPAA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.