GlyR α2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402179-ACT

GLRA2 codifica la subunità alfa-2 del recettore della glicina umano (GlyR α2), un canale del cloruro attivato da ligando che media una rapida neurotrasmissione inibitoria nel sistema nervoso centrale. In seguito al legame con la glicina, GlyR α2 favorisce l’ingresso di cloruro e l’iperpolarizzazione della membrana, modulando l’eccitabilità neuronale e la trasmissione sinaptica durante lo sviluppo e nei circuiti maturi. Alterazioni associate a GLRA2 sono state correlate a fenotipi neuroevolutivi e a disturbi legati alle crisi epilettiche, evidenziando l’importanza della segnalazione glicinergica nel mantenimento del tono inibitorio. Questo recettore si integra funzionalmente con reti neurotrasmettitoriali più ampie e con processi di omeostasi ionica che regolano la maturazione dei circuiti e l’equilibrio eccitatorio–inibitorio.

GlyR α2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GLRA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GlyR α2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GLRA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GLRA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GlyR α2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GLRA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GlyR α2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GlyR α2 nelle cellule tumorali con espressione di GLRA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.