Gemin3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403271-ACT

DDX20 umano codifica Gemin3, un’elicasi dell’RNA della famiglia DEAD-box ATP-dipendente che funge da componente centrale del complesso SMN–Gemin e della via di assemblaggio degli snRNP spliceosomiali. Gemin3 partecipa al metabolismo dell’RNA rimodellando complessi ribonucleoproteici, supportando lo splicing del pre-mRNA, la maturazione degli snRNA e, più in generale, la regolazione genica post-trascrizionale. Attraverso interazioni con SMN e altre proteine Gemin, contribuisce a mantenere la fedeltà dei processi di processamento dell’RNA e la proteostasi nel nucleo e nel citoplasma. La disregolazione dei programmi di processamento dell’RNA associati a DDX20/Gemin3 è stata collegata ad alterazioni delle reti trascrizionali e a fenotipi rilevanti per la malattia in modelli di biologia neuromuscolare e oncologica.

Gemin3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DDX20 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gemin3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DDX20 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DDX20, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gemin3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DDX20 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gemin3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gemin3 nelle cellule tumorali con espressione di DDX20 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.