GC-C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403413-ACT

Il gene umano **GUCY2C** codifica la **guanilato ciclasi C (GC-C)**, un recettore della membrana apicale e una guanilil ciclasi particolata che catalizza la produzione di **cGMP** in risposta ai peptidi endogeni della guanilina e alle enterotossine nell’epitelio intestinale. La segnalazione del cGMP guidata da GC-C regola la secrezione di cloruro e bicarbonato dipendente da **CFTR**, l’equilibrio dei fluidi epiteliali, la funzione di barriera e i programmi di proliferazione–differenziazione attraverso effettori a valle, tra cui **PKG** e vie mediate da canali regolati da nucleotidi ciclici. Questo asse di segnalazione si integra con l’omeostasi intestinale e le risposte infiammatorie, e un’alterata espressione o segnalazione di **GUCY2C** è stata associata alla patofisiologia gastrointestinale e a stati epiteliali associati ai tumori. In quanto recettore di membrana con regolazione trascrizionale dipendente dal contesto, GC-C è spesso studiata nella segnalazione epiteliale, nell’immunologia mucosale e nel crosstalk con le vie oncogeniche.

GC-C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GUCY2C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GC-C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GUCY2C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GUCY2C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GC-C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GUCY2C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GC-C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GC-C nelle cellule tumorali con espressione di GUCY2C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.