GARNL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403936-ACT

Il gene umano **RALGAPA1** codifica la subunità **GARNL1** del complesso proteico con attività GTPasi-attivante (GAP) per Ral, un importante regolatore negativo della segnalazione di **RalA** e **RalB** a valle degli input della famiglia **Ras**. Accelerando l’idrolisi del GTP sulle proteine Ral, GARNL1 contribuisce a modulare processi quali il traffico vescicolare, l’esocitosi, il rimodellamento del citoscheletro e nodi di segnalazione legati al ciclo cellulare che influenzano crescita e migrazione cellulari. Un’attività deregolata della via di Ral è spesso implicata in reti di segnalazione oncogeniche e in alterazioni della dinamica di membrana, rendendo **RALGAPA1/GARNL1** un punto di accesso utile per analizzare la modulazione dell’asse **Ras–Ral**. La perturbazione di questo modulo regolatorio è inoltre rilevante per studiare il cross-talk tra vie di segnalazione **MAPK** e **PI3K** e cambiamenti dipendenti dal contesto nell’adesione e nella polarità cellulari.

GARNL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RALGAPA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GARNL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RALGAPA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RALGAPA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GARNL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RALGAPA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GARNL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GARNL1 nelle cellule tumorali con espressione di RALGAPA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.