GADD 45γ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402483-ACT

GADD45G (GADD45γ) è un membro della famiglia GADD45 responsivo allo stress, che collega segnali genotossici e infiammatori al controllo dei checkpoint del ciclo cellulare, alla segnalazione della riparazione del DNA e all’apoptosi. Partecipa a vie di segnalazione incentrate su MAPK, alle risposte allo stress dipendenti da p53 e alla modulazione dell’attività delle CDK per imporre l’arresto della crescita durante il danno cellulare o i programmi di differenziamento. Attraverso queste funzioni, GADD45γ contribuisce al mantenimento della stabilità genomica e alla regolazione degli stati delle cellule immunitarie ed ematopoietiche. Un’espressione alterata di GADD45G è stata associata a proliferazione deregolata, segnalazione dello stress aberrante e pattern di silenziamento epigenetico riportati in molteplici contesti di malignità, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici delle reti oncosoppressive.

GADD 45γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GADD45G senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GADD 45γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GADD45G nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GADD45G, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GADD 45γ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GADD45G nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GADD 45γ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GADD 45γ nelle cellule tumorali con espressione di GADD45G silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.