GAD-65 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-420471-ACT-2

Il gene Gad2 del topo codifica la glutammato decarbossilasi 65 (GAD-65), un enzima associato alla membrana che converte la L-glutammato nel neurotrasmettitore inibitorio GABA, sostenendo così l’inibizione sinaptica e la stabilità dei circuiti neuronali. La GAD-65 è arricchita negli interneuroni GABAergici e regola la sintesi di GABA dipendente dall’attività e l’approvvigionamento vescicolare di neurotrasmettitore ai terminali presinaptici, collegando il flusso metabolico alla neurotrasmissione e alla plasticità. Alterazioni della funzione di Gad2/GAD-65 sono ampiamente utilizzate come punto di accesso molecolare per studiare l’equilibrio tra eccitazione e inibizione e la sua rilevanza per l’epilessia, i fenotipi legati ad ansia e stress e i disturbi del neurosviluppo. L’editing genetico o modelli murini ingegnerizzati che bersagliano Gad2 consentono l’analisi specifica per tipo cellulare delle reti inibitorie, dell’identità neuronale e del lineage tracing, nonché la dissezione meccanicistica delle vie di segnalazione GABAergiche nel cervello.

GAD-65 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Gad2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GAD-65 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Gad2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Gad2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GAD-65. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Gad2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GAD-65 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GAD-65 nelle cellule tumorali con espressione di Gad2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.