FRYL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-415428-ACT

FRYL umano codifica una grande proteina citoplasmatica implicata nella regolazione della morfologia cellulare e dell’organizzazione del citoscheletro, con collegamenti riportati alla polarità e a processi dipendenti dall’actina che modellano la migrazione e l’architettura dei tessuti. FRYL è stato associato a programmi di controllo trascrizionale e a reti di segnalazione che coordinano crescita e differenziamento, suggerendo un ruolo nel mantenimento dell’omeostasi cellulare durante lo sviluppo e in risposta allo stress. Un’alterata espressione di FRYL o la perturbazione del suo contesto regolatorio sono state osservate in studi genomici e trascrittomici su tumori e altri disturbi complessi, motivando l’indagine su come FRYL influenzi proliferazione, invasione ed espressione genica specifica di linea cellulare. In quanto fattore relativamente poco studiato, FRYL rappresenta un nodo utile per mappare interazioni di regolazione genica e vie accoppiate al citoscheletro in modelli di cellule umane.

FRYL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FRYL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FRYL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FRYL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FRYL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FRYL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FRYL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FRYL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FRYL nelle cellule tumorali con espressione di FRYL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.