FBXO3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403436-ACT

FBXO3 codifica una proteina F-box che funge da componente di riconoscimento del substrato dei complessi ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo SCF (SKP1–CUL1–F-box), contribuendo a indirizzare specifiche proteine verso l’ubiquitinazione e la successiva degradazione proteasomiale. Attraverso la degradazione proteica regolata, FBXO3 può influenzare la segnalazione immunitaria innata e infiammatoria, incluse vie che convergono su programmi trascrizionali dipendenti da NF-κB. In letteratura, un’attività alterata di FBXO3 è stata associata a risposte citochiniche disregolate e a stati cellulari legati allo stress, rendendolo rilevante per studi sull’omeostasi immunitaria e sui meccanismi di malattie associate all’infiammazione. Nell’ambito del sistema ubiquitina–proteasoma, FBXO3 è inoltre utile per analizzare le reti di proteostasi e il controllo dipendente dal contesto degli intermedi della segnalazione.

FBXO3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FBXO3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FBXO3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FBXO3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FBXO3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FBXO3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FBXO3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FBXO3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FBXO3 nelle cellule tumorali con espressione di FBXO3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.