Fap-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401758-ACT

PTPN13 codifica la grande fosfatasi tirosinica proteica non recettoriale Fap-1 (nota anche come PTP-BAS), una proteina “scaffold” con domini multipli PDZ che integra l’attività fosfatasica con interazioni proteina–proteina a livello della membrana plasmatica e del citoscheletro. Fap-1 modula gli esiti della segnalazione de-fosforilando substrati chiave e organizzando complessi associati ai recettori, influenzando processi quali la regolazione dell’apoptosi, l’adesione cellulare e la migrazione. Attraverso interazioni con vie collegate alla segnalazione dei recettori e alla dinamica delle giunzioni, PTPN13 contribuisce a plasmare le risposte cellulari a segnali di crescita e di stress. Alterazioni dell’espressione di PTPN13/Fap-1 o dell’equilibrio di segnalazione sono state associate a una sopravvivenza deregolata e a fenotipi invasivi riportati in diversi contesti patologici, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sul controllo della segnalazione.

Fap-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTPN13 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fap-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTPN13 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTPN13, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fap-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTPN13 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fap-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fap-1 nelle cellule tumorali con espressione di PTPN13 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.