EXOSC8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405322-ACT

EXOSC8 codifica una subunità centrale del complesso dell’esosoma dell’RNA umano, un’esoribonucleasi multiproteica 3′–5′ che regola il controllo qualità e il turnover degli RNA nel nucleo e nel citoplasma. Attraverso la lavorazione e la degradazione coordinate di rRNA, snRNA, snoRNA e degli intermedi di decadimento dell’mRNA, EXOSC8 contribuisce a vie di sorveglianza dell’RNA che mantengono l’integrità del trascrittoma e la proteostasi. L’alterazione della funzione dell’esosoma compromette la biogenesi dei ribosomi, l’omeostasi trascrizionale e le risposte allo stress, collegando la disregolazione di EXOSC8 a fenotipi di neurosviluppo e neurodegenerazione riportati per i geni associati all’esosoma. Di conseguenza, EXOSC8 rappresenta un bersaglio utile per studiare il metabolismo dell’RNA, l’elaborazione co-trascrizionale e i meccanismi di decadimento dell’RNA nelle cellule umane.

EXOSC8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EXOSC8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EXOSC8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EXOSC8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EXOSC8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EXOSC8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EXOSC8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EXOSC8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EXOSC8 nelle cellule tumorali con espressione di EXOSC8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.