EP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402565-ACT

PTGER1 codifica il recettore umano EP1 della prostaglandina E2, un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) che si associa preferenzialmente a Gq/11 per aumentare il Ca2+ intracellulare e attivare una segnalazione dipendente da PKC. EP1 integra gli input dei prostanoidi a valle delle vie della cicloossigenasi per regolare il tono della muscolatura liscia, il trasporto ionico epiteliale e le risposte neuroinfiammatorie, con ulteriori interazioni (cross-talk) con MAPK e programmi trascrizionali dipendenti dal calcio. Un’alterata segnalazione PTGER1/EP1 è stata studiata nel rimodellamento tissutale guidato dall’infiammazione e nella sensibilizzazione al dolore, ed è stata implicata in una regolazione dipendente dal contesto della proliferazione e della migrazione cellulare. Queste caratteristiche rendono EP1 un nodo utile per analizzare le reti di segnalazione responsiva a PGE2 e i cambiamenti di espressione genica a valle in modelli cellulari umani.

EP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTGER1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTGER1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTGER1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTGER1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EP1 nelle cellule tumorali con espressione di PTGER1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.