Endothelin-3/EDN3/ET-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404436-ACT

EDN3 codifica l’endotelina-3 (ET-3), un peptide vasoattivo secreto della famiglia delle endoteline che segnala principalmente attraverso il recettore dell’endotelina di tipo B (EDNRB) per regolare la migrazione delle cellule derivate dalla cresta neurale, la specificazione della linea melanocitaria e lo sviluppo del sistema nervoso enterico. ET-3 contribuisce al controllo paracrino del tono della muscolatura liscia e dell’omeostasi vascolare tramite vie mediate da GPCR che coinvolgono la fosfolipasi C, i flussi intracellulari di calcio e la segnalazione MAPK. In contesti di sviluppo e di patterning tissutale, la segnalazione EDN3–EDNRB interagisce con vie che controllano proliferazione e differenziamento, includendo il crosstalk con programmi dipendenti da WNT e KIT nella biologia delle cellule pigmentarie. La deregolazione della segnalazione di EDN3 è associata a disturbi dello sviluppo della cresta neurale e della pigmentazione, ed è spesso studiata per i suoi ruoli nell’innervazione gastrointestinale e nelle dinamiche di segnalazione del microambiente.

Endothelin-3/EDN3/ET-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EDN3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Endothelin-3/EDN3/ET-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EDN3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EDN3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Endothelin-3/EDN3/ET-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EDN3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Endothelin-3/EDN3/ET-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Endothelin-3/EDN3/ET-3 nelle cellule tumorali con espressione di EDN3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.