EGFL8 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-429875-ACT

Egfl8 codifica EGFL8, una proteina secreta associata alla matrice extracellulare contenente domini tipo EGF, che supporta la comunicazione cellula–cellula e cellula–matrice. Nei tessuti murini, l’espressione di EGFL8 è stata collegata alla regolazione del patterning dello sviluppo, del comportamento di cellule epiteliali ed endoteliali e di processi di rimodellamento extracellulare che influenzano adesione, migrazione e organizzazione tissutale. Attraverso questi ruoli, EGFL8 è rilevante in contesti di segnalazione che coordinano la morfogenesi e le interazioni tra stroma e parenchima, incluse vie che interagiscono con programmi responsivi ai fattori di crescita. Un’attività o un’espressione alterata di EGFL8 viene quindi studiata in modelli di rimodellamento tissutale deregolato e di biologia delle malattie proliferative, in cui cambiamenti del microambiente possono influenzare il destino cellulare e fenotipi associati all’invasione.

EGFL8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Egfl8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EGFL8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Egfl8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Egfl8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EGFL8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Egfl8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EGFL8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EGFL8 nelle cellule tumorali con espressione di Egfl8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.