EAT-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403780-ACT

SH2D1B codifica EAT-2, un adattatore contenente un dominio SH2 espresso prevalentemente nelle cellule ematopoietiche, che collega la segnalazione dei recettori della famiglia SLAM, inclusi CD244/2B4 e CD84, ai programmi effettrici immunitari a valle. Legandosi a motivi di fosfotirosina sui recettori attivati e assemblando complessi di segnalazione, EAT-2 modula le soglie di attivazione dei linfociti, le risposte dei granuli citotossici e la produzione di citochine, in particolare nelle cellule NK e in sottopopolazioni di cellule T e di cellule presentanti l’antigene. Questo adattatore contribuisce a un controllo fine delle vie dipendenti dagli ITSM che modellano la formazione della sinapsi immunologica e le reti di segnalazione infiammatoria. Un’attività deregolata di SH2D1B/EAT-2 è stata associata ad alterazioni della sorveglianza immunitaria e a fenotipi infiammatori, rendendolo rilevante per studi meccanicistici in immunologia e biologia del cancro.

EAT-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SH2D1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EAT-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SH2D1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SH2D1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EAT-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SH2D1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EAT-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EAT-2 nelle cellule tumorali con espressione di SH2D1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.