EAF1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-428881-ACT

Il gene murino *Eaf1* codifica EAF1, un cofattore trascrizionale nucleare originariamente caratterizzato come fattore associato a ELL che contribuisce a coordinare l’elongazione della RNA polimerasi II e i programmi di espressione genica. EAF1 partecipa a complessi regolatori associati alla cromatina ed è stato collegato al controllo della progressione del ciclo cellulare, della differenziazione e degli output trascrizionali in risposta allo stress. Attraverso il suo ruolo nella regolazione trascrizionale, EAF1 può influenzare vie che governano la proliferazione e le reti geniche dello sviluppo, risultando quindi rilevante per studi sulla trascrizione deregolata in oncologia e in altri contesti in cui il controllo dell’espressione genica è alterato. L’indagine della funzione di *Eaf1* supporta la dissezione meccanicistica dell’elongazione trascrizionale e degli eventi regolatori prossimali al promotore nelle cellule dei mammiferi.

EAF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Eaf1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EAF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Eaf1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Eaf1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EAF1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Eaf1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EAF1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EAF1 nelle cellule tumorali con espressione di Eaf1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.