dystrophin Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420021-ACT

Dmd codifica la distrofina, una grande proteina citoscheletrica che collega la rete di actina al complesso distrofina–glicoproteine a livello del sarcolemma, sostenendo la stabilità della membrana durante la contrazione muscolare. Nel muscolo scheletrico e cardiaco del topo, la distrofina contribuisce alla meccanotrasduzione, all’organizzazione dei costameri e al mantenimento dell’omeostasi del calcio, con effetti a valle sulle vie dell’infiammazione e del rimodellamento fibrotico quando la sua espressione è ridotta. L’alterazione o la ridotta funzionalità della distrofina è associata a danno progressivo delle miofibre e a una compromessa integrità muscolare, rendendo Dmd un gene centrale per lo studio dei fenotipi di degenerazione muscolare. I processi dipendenti da Dmd sono inoltre rilevanti per modellare cambiamenti nella segnalazione della matrice extracellulare, nelle risposte allo stress e nei programmi trascrizionali dei mionuclei in contesti di malattie neuromuscolari.

dystrophin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Dmd senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

dystrophin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Dmd nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Dmd, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di dystrophin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Dmd nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da dystrophin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via dystrophin nelle cellule tumorali con espressione di Dmd silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.