Dyrk1A Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-401928-LAC

DYRK1A codifica la chinasi 1A a doppia specificità regolata dalla fosforilazione su tirosina (Dyrk1A), una chinasi serina/treonina che si autofosforila su tirosina e modula la fosforilazione di diversi substrati nucleari e citoplasmatici. Dyrk1A contribuisce al controllo del ciclo cellulare, alla differenziazione neuronale, alla funzione sinaptica e alla proteostasi attraverso la regolazione di fattori di trascrizione, componenti dello splicing e intermedi della segnalazione, intersecando vie quali MAPK/ERK, la trascrizione dipendente da NFAT e il controllo di ribosomi/traduzione. Alterazioni del dosaggio di DYRK1A sono fortemente implicate in fenotipi del neurosviluppo, inclusi quelli associati alla trisomia 21, e varianti del gene sono collegate alla disabilità intellettiva e a tratti correlati allo spettro dell’autismo. Un’attività di DYRK1A deregolata è stata inoltre studiata nel contesto della biologia dei tumori e di reti di fosforilazione rilevanti per la neurodegenerazione.

Le particelle di attivazione lentivirale Dyrk1A (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di DYRK1A in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Dyrk1A (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione DYRK1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Dyrk1A. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo DYRK1A e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.