Dnmt3b Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420036-ACT

Il gene murino **Dnmt3b** codifica una DNA metiltransferasi *de novo* che deposita 5-metilcitosina nei dinucleotidi CpG per instaurare e mantenere il silenziamento epigenetico durante lo sviluppo embrionale e l’impegno di linea. **DNMT3B** coopera con **DNMT3A** e con la metilazione di mantenimento mediata da **UHRF1/DNMT1** per modellare lo stato della cromatina, i programmi trascrizionali e la stabilità genomica, includendo la repressione degli elementi trasponibili e la regolazione dell’imprinting. Questo enzima si integra con i percorsi di rimodellamento della cromatina e di modificazione degli istoni, influenzando la dinamica della metilazione di promotori ed enhancer durante la differenziazione e la riprogrammazione. Un’alterata attività di **DNMT3B** è associata a pattern di metilazione anomali osservati in disordini dello sviluppo e nella deregolazione epigenetica legata al cancro, rendendolo un nodo centrale per lo studio della regolazione genica dipendente dall’epigenoma.

Dnmt3b Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Dnmt3b senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dnmt3b Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Dnmt3b nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Dnmt3b, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dnmt3b. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Dnmt3b nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dnmt3b nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dnmt3b nelle cellule tumorali con espressione di Dnmt3b silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.