DnaJB6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404227-ACT

DNAJB6 codifica il co-chaperone DnaJB6 della famiglia Hsp40, una proteina contenente un dominio J che coopera con Hsp70 per regolare il ripiegamento delle proteine, il loro smistamento e la degradazione. DnaJB6 è arricchita in vie che controllano la proteostasi, inclusi la soppressione dell’aggregazione amiloidogenica, la modulazione dell’autofagia e il coordinamento del controllo qualità ubiquitina–proteasoma in condizioni di stress cellulare. Attraverso questi ruoli, DNAJB6 influenza l’organizzazione del citoscheletro e i programmi miogenici ed è associata a disturbi caratterizzati da misfolding proteico e degenerazione muscolare, inclusa la distrofia muscolare dei cingoli. Un’alterata attività di DNAJB6 è inoltre studiata nel contesto dell’adattamento allo stress cellulare e dell’instabilità del proteoma, aspetti rilevanti per la ricerca sulla neurodegenerazione e sulla biologia del cancro.

DnaJB6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DNAJB6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DnaJB6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DNAJB6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DNAJB6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DnaJB6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DNAJB6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DnaJB6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DnaJB6 nelle cellule tumorali con espressione di DNAJB6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.