Dhh Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403357-ACT

Il gene umano DHH codifica Desert hedgehog (Dhh), un morfogeno secreto della famiglia Hedgehog che regola la specificazione del destino cellulare e il patterning dei tessuti attraverso la segnalazione canonica PTCH1–SMO e i fattori di trascrizione GLI a valle. Dhh è particolarmente importante nello sviluppo dei nervi periferici e nella differenziazione gonadica, coordinando la maturazione della linea delle cellule di Schwann e la funzione delle cellule somatiche del testicolo. Alterazioni dell’espressione di DHH o dell’attività della via sono state associate a disturbi dello sviluppo sessuale e a fenotipi correlati alla neuropatia periferica, e Dhh è frequentemente studiato come regolatore dipendente dal contesto di programmi di segnalazione dello sviluppo. In quanto nodo di una via attivata da ligando, Dhh offre un punto di intervento pratico per analizzare la comunicazione paracrina, i gradienti di morfogeno e le risposte trascrizionali in sistemi modello basati su cellule staminali, organoidi e modelli di sviluppo.

Dhh Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DHH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dhh Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DHH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DHH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dhh. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DHH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dhh nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dhh nelle cellule tumorali con espressione di DHH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.