Decorin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400786-ACT

DCN codifica la decorina, un piccolo proteoglicano secreto ricco in leucine che si lega ai collageni fibrillari e regola l’assemblaggio della matrice extracellulare (ECM), la biomeccanica dei tessuti e l’adesione cellula–matrice. La decorina modula assi di segnalazione chiave, tra cui TGF-β/SMAD e vie delle tirosin-chinasi recettoriali come EGFR, influenzando l’attivazione dei fibroblasti, la differenziazione in miofibroblasti e il rimodellamento infiammatorio. Grazie ai suoi ruoli nella fibrillogenesi del collagene e nel sequestro di fattori di crescita, DCN è spesso studiato nella fibrosi, nella biologia del microambiente tumorale, nella riparazione delle ferite e nell’omeostasi del tessuto connettivo. Un’espressione disregolata della decorina o un’organizzazione alterata dell’ECM sono state associate a rimodellamento patologico in molteplici sistemi d’organo, a supporto della sua utilità come nodo di segnalazione dell’ECM nella ricerca di meccanobiologia.

Decorin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DCN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Decorin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DCN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DCN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Decorin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DCN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Decorin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Decorin nelle cellule tumorali con espressione di DCN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.