DDX27 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409574-ACT

DDX27 codifica un’elicasi dell’RNA di tipo DEAD-box localizzata nel nucleolo, che partecipa al processamento del pre-rRNA e alla biogenesi dei ribosomi, sostenendo l’assemblaggio efficiente delle grandi subunità ribosomali e la capacità traslazionale globale. Rimodellando i complessi RNA-proteina nel nucleolo, DDX27 contribuisce alla regolazione dei programmi di crescita e proliferazione cellulare che dipendono da una sintesi proteica finemente controllata. L’alterazione della produzione di ribosomi e dell’omeostasi nucleolare è collegata all’attivazione di segnali di stress cellulare e a cambiamenti nella differenziazione, rendendo DDX27 rilevante per lo studio delle ribosomopatie e della riscrittura della traduzione associata al cancro. Un’attività aberrante di DDX27 è stata associata a fenotipi proliferativi e a difetti nei processi miogenici e nello sviluppo in sistemi modello, supportandone l’impiego come nodo meccanicistico nella ricerca sul metabolismo dell’RNA.

DDX27 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DDX27 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DDX27 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DDX27 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DDX27, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DDX27. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DDX27 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DDX27 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DDX27 nelle cellule tumorali con espressione di DDX27 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.