Cytokeratin 4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401893-ACT

KRT4 codifica la citocheratina 4, una proteina dei filamenti intermedi di tipo II che eterodimerizza con le cheratine di tipo I per costruire la rete di filamenti di cheratina negli epiteli stratificati non cheratinizzati, inclusa la mucosa orale ed esofagea. Questo impalcato citoscheletrico sostiene l’integrità meccanica dell’epitelio, l’organizzazione delle giunzioni cellula–cellula e i programmi di differenziamento, coordinati con il turnover delle cheratine, la proteostasi e la segnalazione responsiva allo stress. Alterazioni dell’espressione di KRT4 o dell’assemblaggio dei filamenti possono compromettere la funzione di barriera epiteliale e l’architettura tissutale, rendendolo rilevante per studi sull’omeostasi delle mucose, sul rimodellamento associato a irritazione e sulla displasia epiteliale. In quanto gene strutturale legato al differenziamento, KRT4 è spesso utilizzato come readout molecolare nel lineage tracing epiteliale e nelle analisi della regolazione trascrizionale.

Cytokeratin 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KRT4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cytokeratin 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KRT4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KRT4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cytokeratin 4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KRT4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cytokeratin 4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cytokeratin 4 nelle cellule tumorali con espressione di KRT4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.