CYP7A1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419932-ACT

Il gene murino Cyp7a1 codifica la colesterolo 7α-idrossilasi (CYP7A1), un enzima del citocromo P450 arricchito nel fegato che catalizza la tappa limitante la velocità nella via classica di sintesi degli acidi biliari a partire dal colesterolo. Controllando la conversione del colesterolo in 7α-idrossicolesterolo, CYP7A1 determina la dimensione e la composizione del pool di acidi biliari, influenzando la segnalazione enteroepatica tramite FXR/FGF15 e la conseguente regolazione del metabolismo dei lipidi, del glucosio e dell’energia. L’attività di Cyp7a1 integra l’omeostasi epatica del colesterolo con programmi trascrizionali dipendenti dagli acidi biliari, intersecandosi con il metabolismo delle lipoproteine e con le reti di processamento degli xenobiotici. Un’espressione disregolata di CYP7A1 è spesso studiata nel contesto dell’ipercolesterolemia, di fenotipi di fegato grasso e di modelli di infiammazione metabolica in cui la segnalazione degli acidi biliari risulta alterata.

CYP7A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cyp7a1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CYP7A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cyp7a1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cyp7a1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CYP7A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cyp7a1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CYP7A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CYP7A1 nelle cellule tumorali con espressione di Cyp7a1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.