CT45-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416782-ACT

CT45A1 codifica CT45-1, un antigene cancro/testicolo con espressione fortemente limitata nei tessuti normali dell’adulto e frequente ri-espressione in molteplici contesti tumorali, rendendolo un marcatore utile per studiare la disregolazione epigenetica e la trascrizione inappropriata per linea cellulare. Sebbene la sua funzione molecolare precisa non sia ancora completamente definita, CT45-1 è stato collegato a programmi trascrizionali associati alla plasticità cellulare e a stati adattativi allo stress, inclusi processi che supportano proliferazione e sopravvivenza in presenza di segnalazione oncogenica. L’espressione aberrante di CT45A1 è comunemente associata all’immunogenicità e all’eterogeneità tumorale, ed è spesso studiata insieme ad altri antigeni con espressione ristretta alla linea germinale che riflettono stati della cromatina alterati. Queste caratteristiche rendono CT45A1/CT45-1 rilevante per indagare circuiti regolatori che accoppiano rimodellamento della cromatina, controllo trascrizionale ed espressione di antigeni associati al tumore.

CT45-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CT45A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CT45-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CT45A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CT45A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CT45-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CT45A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CT45-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CT45-1 nelle cellule tumorali con espressione di CT45A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.