CRF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400770-ACT

Humanes **CRH** kodiert das Corticotropin-Releasing-Hormon (**CRF**), ein Neuropeptid, das die Hypothalamus‑Hypophysen‑Nebennierenrinden‑Achse (**HPA‑Achse**) initiiert, indem es die **ACTH**‑Sekretion aus hypophysären Corticotrophen stimuliert und systemische Stressantworten koordiniert. CRF signalisiert vor allem über **CRHR1/CRHR2** und aktiviert dabei **Gs–Adenylatcyclase–cAMP–PKA**‑Signalwege sowie nachgeschaltete Transkriptionsprogramme, die neuroendokrine, immunologische und autonome Prozesse modulieren. Im Gehirn und in peripheren Geweben trägt CRH/CRF über integrierte neuroendokrine Schaltkreise zur Regulation von angstähnlichem Verhalten, Wachheit, Appetit und Entzündungstonus bei. Eine Fehlregulation der CRH‑Expression und ‑Signalübertragung wurde mit stressassoziierten neuropsychiatrischen Phänotypen und einer veränderten endokrinen Homöostase in Verbindung gebracht, was CRH zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Untersuchungen der Stressschaltkreise und hormonregulierter Gennetzwerke macht.

CRF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CRH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CRF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CRH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CRH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CRF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CRH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CRF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CRF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CRH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.