connexin 36 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402740-ACT

GJD2 codifica la connessina 36 (Cx36), una proteina delle giunzioni comunicanti (gap junction) che si assembla in canali intercellulari, consentendo un accoppiamento elettrico e metabolico diretto tra cellule adiacenti. L’accoppiamento mediato da Cx36 favorisce la scarica sincronizzata e le oscillazioni di rete, in particolare nei circuiti neuronali, permettendo un rapido flusso di ioni e lo scambio di piccole molecole attraverso le membrane. Nel sistema nervoso centrale e in altri tessuti eccitabili, la connessina 36 influenza l’integrazione sinaptica, la propagazione del segnale e la plasticità dipendente dall’attività tramite la regolazione dell’assemblaggio e del gating delle gap junction. Alterazioni dell’espressione di GJD2/connessina 36 o dell’accoppiamento sono state implicate in disfunzioni neurofisiologiche e vengono studiate nel contesto di disturbi caratterizzati da una sincronia neuronale compromessa.

connexin 36 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GJD2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

connexin 36 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GJD2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GJD2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di connexin 36. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GJD2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da connexin 36 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via connexin 36 nelle cellule tumorali con espressione di GJD2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.