COL12A1 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-402361-LAC

COL12A1 codifica per la catena alfa 1 del collagene di tipo XII, un collagene associato alle fibrille con eliche triple interrotte (FACIT) che si localizza nella matrice extracellulare e regola la fibrillogenesi del collagene, la resistenza alla trazione dei tessuti e la meccanotrasduzione. Organizzando le fibrille ricche di collagene I e interagendo con proteoglicani e recettori di superficie cellulare, COL12A1 contribuisce al rimodellamento della matrice, all’adesione cellulare e ai programmi di migrazione che influenzano lo sviluppo e l’omeostasi muscoloscheletrica. Alterazioni dell’espressione o della funzione di COL12A1 sono state collegate a fenotipi ereditari del tessuto connettivo e a una disregolazione della matrice extracellulare, rendendolo rilevante per studi sulla biologia di tendini/legamenti, sulla fibrosi e sulla segnalazione guidata dalla matrice. Questi ruoli rendono COL12A1 un nodo utile per analizzare come l’architettura della ECM plasmi il comportamento cellulare e le risposte allo stress.

Le particelle di attivazione lentivirale COL12A1 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di COL12A1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale COL12A1 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione COL12A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di COL12A1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo COL12A1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.