claudin-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401756-ACT

CLDN3 codifica la claudina-3, una proteina delle tight junction a quattro domini transmembrana che contribuisce all’integrità della barriera epiteliale e alla polarità apico-basolaterale regolando la permeabilità paracellulare e l’architettura dei filamenti giunzionali. La claudina-3 coopera con altre claudine e con proteine scaffold delle giunzioni per coordinare l’adesione cellula-cellula e le vie di segnalazione legate all’omeostasi epiteliale, includendo il crosstalk con programmi di rimodellamento associati all’EMT. Un’alterata espressione di CLDN3 e la disorganizzazione delle tight junction sono frequentemente associate alla biologia dei tumori epiteliali, in cui cambiamenti della funzione di barriera e della polarità possono influenzare invasione, metastasi e interazioni con il microambiente. In quanto componente giunzionale associata alla membrana, la claudina-3 è rilevante anche per studi sulla compartimentalizzazione dei tessuti, sul trasporto di farmaci attraverso gli epiteli e sugli stati di differenziazione specifici di linea.

claudin-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CLDN3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

claudin-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CLDN3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CLDN3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di claudin-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CLDN3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da claudin-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via claudin-3 nelle cellule tumorali con espressione di CLDN3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.