CHMP4A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402539-ACT

CHMP4A umano codifica un componente centrale del macchinario ESCRT-III che rimodella le membrane per guidare la formazione di vescicole intraluminali durante la biogenesi dei corpi multivescicolari e lo smistamento del carico endosomiale. CHMP4A partecipa anche all’abscissione citocinetica e contribuisce a coordinare eventi di scissione della membrana importanti per la riparazione della membrana plasmatica e la downregulation dei recettori. Attraverso questi ruoli, CHMP4A influenza la proteostasi e l’attenuazione delle vie di segnalazione, incluso il controllo, dipendente dal traffico vescicolare, degli output dei recettori dei fattori di crescita. La disfunzione di ESCRT è ampiamente collegata alla segnalazione oncogenica, a processi neurodegenerativi e alla suscettibilità a patogeni che sfruttano il gemmamento dipendente da ESCRT, rendendo CHMP4A un nodo utile per studi meccanicistici sul rimodellamento delle membrane.

CHMP4A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHMP4A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CHMP4A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHMP4A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHMP4A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CHMP4A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHMP4A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CHMP4A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CHMP4A nelle cellule tumorali con espressione di CHMP4A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.