Cdt2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407212-ACT

Il gene umano **DTL** codifica **Cdt2**, un recettore di substrato per il complesso di ligasi E3 dell’ubiquitina **CRL4^Cdt2**, che coordina la progressione del ciclo cellulare con la replicazione e la riparazione del DNA. Cdt2 promuove la fedeltà della fase S indirizzando fattori chiave del licensing della replicazione e del checkpoint, tra cui **CDT1**, **p21 (CDKN1A)** e **SETD8**, verso ubiquitinazione dipendente da **PCNA** e degradazione proteasomiale durante la sintesi del DNA e dopo stress genotossico. Attraverso queste funzioni, influenza il controllo delle origini di replicazione, la stabilità del genoma e la segnalazione della risposta al danno al DNA. Un’attività deregolata di DTL/Cdt2 è stata associata a fenotipi proliferativi e a un controllo alterato dei checkpoint in contesti rilevanti per il cancro, rendendolo un nodo utile per studiare lo stress replicativo oncogenico e le vulnerabilità del ciclo cellulare.

Cdt2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DTL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdt2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DTL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DTL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdt2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DTL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdt2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdt2 nelle cellule tumorali con espressione di DTL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.