CD77 synthase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404828-ACT

A4GALT codifica la CD77 sintasi, una glicosiltransferasi localizzata nel Golgi che catalizza l’aggiunta di galattosio al lattosilceramide per generare il globotriaosilceramide (Gb3/CD77), un importante glicosfingolipide neutro. Modellando la biosintesi dei glicosfingolipidi, la CD77 sintasi influenza l’organizzazione dei microdomini di membrana, il traffico proteico e i processi di riconoscimento cellula-cellula rilevanti per la biologia delle cellule immunitarie ed epiteliali. Alterazioni dell’attività di A4GALT e dell’abbondanza di CD77/Gb3 sono state associate a cambiamenti nello stato di differenziamento e nella suscettibilità a interazioni dipendenti dai glicani, incluse vie implicate nella biologia delle cellule B e in fenotipi di glicosilazione associati ai tumori. Di conseguenza, A4GALT è spesso studiato nel contesto del metabolismo dei glicosfingolipidi, del rimodellamento del glicoma e della regolazione degli antigeni di superficie cellulare.

CD77 synthase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di A4GALT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD77 synthase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus A4GALT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione A4GALT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD77 synthase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus A4GALT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD77 synthase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD77 synthase nelle cellule tumorali con espressione di A4GALT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.