CD73 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423919-ACT

Nt5e nel topo codifica CD73 (ecto-5′-nucleotidasi), un enzima di superficie cellulare ancorato tramite GPI che idrolizza l’AMP extracellulare in adenosina, modulando la segnalazione purinergica e l’equilibrio tra segnali pro-infiammatori mediati da ATP/AMP e l’immunomodulazione mediata dall’adenosina. L’attività di CD73 influenza la funzione della barriera vascolare ed epiteliale, il traffico leucocitario e i programmi di protezione tissutale attraverso le vie dei recettori dell’adenosina e la segnalazione associata al cAMP. Nel microambiente tumorale e nei tessuti con infiammazione cronica, l’asse CD39–CD73 può contribuire a un’immunosoppressione metabolica, a un rimodellamento stromale alterato e a una ridotta immunità antitumorale, rendendo Nt5e un bersaglio frequente negli studi di biologia del cancro, autoimmunità e fibrosi. In quanto ectoenzima di superficie, CD73 viene anche utilizzato per analizzare le transizioni di stato cellulare e il controllo microambientale dei fenotipi immunitari ed endoteliali.

CD73 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nt5e senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD73 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nt5e nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nt5e, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD73. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nt5e nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD73 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD73 nelle cellule tumorali con espressione di Nt5e silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.