CD39 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419549-ACT

Entpd1 codifica CD39 (ecto-nucleoside trifosfato difosfoidrolasi-1), un’ectonucleotidasi di superficie cellulare che idrolizza ATP e ADP extracellulari in AMP, modellando la segnalazione purinergica e l’infiammazione guidata dai nucleotidi. Controllando la disponibilità di ATP/ADP per l’attivazione dei recettori P2 e fornendo substrato per la produzione di adenosina dipendente da CD73, CD39 regola l’attivazione delle cellule immunitarie, la funzione piastrinica e le risposte endoteliali. Nei sistemi murini, l’attività di CD39 viene spesso studiata nel contesto dell’infiammazione vascolare, della regolazione della trombosi e dei circuiti immunoregolatori che influenzano il danno tissutale e l’immunosoppressione associata ai tumori. Un’espressione alterata di ENTPD1/CD39 è inoltre collegata a stati infiammatori cronici, in cui il metabolismo dei nucleotidi extracellulari influisce sul reclutamento dei leucociti e sulla segnalazione delle citochine.

CD39 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Entpd1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD39 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Entpd1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Entpd1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD39. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Entpd1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD39 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD39 nelle cellule tumorali con espressione di Entpd1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.