CD133 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-437381-ACT

Prom1 codifica la glicoproteina di membrana pentaspan CD133, un marcatore di superficie cellulare arricchito nei compartimenti di cellule staminali e progenitrici di molteplici tessuti murini. CD133 si localizza nelle protrusioni della membrana plasmatica ed è stata collegata alla regolazione della polarità cellulare, dell’organizzazione di membrana e di programmi di segnalazione che influenzano l’autorinnovamento e l’impegno di linea, inclusi i processi associati a Wnt/β-catenina, PI3K–AKT, Notch e Hedgehog. Un’alterata espressione di PROM1/CD133 è frequentemente associata a fenotipi di cellule iniziatrici di tumore, al potenziale metastatico e a firme di resistenza alle terapie in diversi modelli di cancro, ed è inoltre studiata nel contesto della rigenerazione tissutale e del neurosviluppo. Nei sistemi murini, Prom1 rappresenta uno strumento maneggevole per interrogare stati “stem-like”, l’organizzazione epiteliale e le traiettorie di differenziamento mediante approcci di perturbazione genetica.

CD133 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Prom1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD133 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Prom1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Prom1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD133. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Prom1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD133 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD133 nelle cellule tumorali con espressione di Prom1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.