CCDC23 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-415702-ACT

SVBP codifica CCDC23, una proteina contenente un dominio coiled-coil implicata in processi associati al centrosoma e nell’organizzazione dei microtubuli, con ruoli riportati nella regolazione del fuso mitotico e della segregazione dei cromosomi. Attraverso queste funzioni, CCDC23 è in grado di influenzare la progressione del ciclo cellulare e le vie della stabilità genomica, spesso alterate in contesti di malattie proliferative. Un’espressione alterata o la disregolazione di fattori centrosomiali e associati al fuso è comunemente collegata ad aneuploidia e a risposte allo stress cellulare, rendendo SVBP/CCDC23 rilevante per studi meccanicistici in biologia del cancro e in modelli correlati. La sua localizzazione intracellulare e le caratteristiche di impalcatura previste ne supportano inoltre l’uso come strumento per esplorare le reti di interazione proteica che governano la mitosi e la dinamica del citoscheletro.

CCDC23 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SVBP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CCDC23 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SVBP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SVBP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CCDC23. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SVBP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CCDC23 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CCDC23 nelle cellule tumorali con espressione di SVBP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.