CaM II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400952-ACT

Il gene umano **CALM2** codifica la calmodulina (CaM II), un sensore ubiquitario di Ca2+ che trasduce i transitori intracellulari di calcio in segnali regolatori legandosi e modulando numerosi enzimi, canali ionici e regolatori della trascrizione. Attraverso la segnalazione dipendente da Ca2+/calmodulina, contribuisce a processi che includono l’accoppiamento eccitazione–contrazione, la plasticità sinaptica, il controllo del ciclo cellulare e l’espressione genica dipendente dallo stimolo, intersecandosi con vie quali la segnalazione CaMK, l’attivazione calcineurina/NFAT e le dinamiche di Ca2+ avviate dai GPCR. Il buffering e la decodifica dei segnali di Ca2+ mediati da CALM2 supportano la funzione mitocondriale e l’eccitabilità di membrana, plasmando le reti di fosforilazione a valle e l’omeostasi del calcio. Una segnalazione della calmodulina deregolata e varianti patogeniche di CALM2 sono state associate a fenotipi aritmogeni e a più ampie disfunzioni neuro-cardiache, rendendo CALM2 un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sulla biologia delle malattie guidate dal calcio.

CaM II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CALM2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CaM II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CALM2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CALM2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CaM II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CALM2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CaM II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CaM II nelle cellule tumorali con espressione di CALM2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.