calsequestrin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403375-ACT

CASQ1 codifica la calsequestrina 1, una proteina a elevata capacità di legame del Ca2+ localizzata nel lume del reticolo sarcoplasmatico nelle fibre muscolari scheletriche a contrazione rapida. Tamponando e rilasciando il Ca2+ luminale, la calsequestrina 1 supporta l’accoppiamento eccitazione–contrazione e contribuisce a modulare la dinamica del rilascio di Ca2+ mediato dal recettore della rianodina, influenzando l’omeostasi del calcio, la contrattilità muscolare e la stabilità delle riserve di Ca2+ del reticolo sarcoplasmatico. L’alterazione della funzione di CASQ1 è stata associata a cambiamenti nella segnalazione intracellulare del Ca2+ e nelle risposte allo stress nel muscolo scheletrico, offrendo un punto di accesso meccanicistico per lo studio di vie dipendenti dal Ca2+, della proteostasi e della fisiologia delle miofibre. In quanto regolatore chiave del buffering del Ca2+ nel reticolo sarcoplasmatico, CASQ1 viene spesso analizzato in modelli di disfunzione muscolare in cui un’alterata gestione del Ca2+ contribuisce alla patologia.

calsequestrin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CASQ1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

calsequestrin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CASQ1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CASQ1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di calsequestrin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CASQ1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da calsequestrin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via calsequestrin 1 nelle cellule tumorali con espressione di CASQ1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.