CAF-1 p150 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402472-ACT

CHAF1A codifica CAF-1 p150, la subunità più grande del complesso chromatin assembly factor-1 (CAF-1), che deposita gli istoni H3–H4 sul DNA di nuova sintesi durante l’assemblaggio dei nucleosomi accoppiato alla replicazione. Coordinando la replicazione del DNA con il ripristino della cromatina, CAF-1 p150 sostiene la progressione della fase S, la stabilità della forcella replicativa e il mantenimento degli stati epigenetici, contribuendo inoltre all’integrità del genoma tramite interazioni con PCNA e fattori di riparazione del DNA. L’alterazione della funzione di CAF-1 è associata a stress replicativo, modifiche nell’organizzazione dell’eterocromatina e programmi trascrizionali aberranti, processi spesso studiati nel contesto della biologia delle patologie proliferative. L’attività di CHAF1A è quindi rilevante per le vie che regolano la risposta al danno al DNA, la dinamica della cromatina e il controllo del ciclo cellulare.

CAF-1 p150 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHAF1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CAF-1 p150 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHAF1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHAF1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CAF-1 p150. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHAF1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CAF-1 p150 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CAF-1 p150 nelle cellule tumorali con espressione di CHAF1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.