CA IX Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400905-ACT

Il gene umano **CA9** codifica l’anidrasi carbonica IX (CA IX), un enzima inducibile dall’ipossia e associato alla membrana che catalizza l’idratazione reversibile della CO₂, regolando l’acidificazione extracellulare e l’omeostasi del pH intracellulare. CA IX sostiene l’adattamento cellulare allo stress da basso ossigeno e si integra con la segnalazione HIF-1, le reti di trasporto ionico e la riprogrammazione metabolica che influenzano la sopravvivenza cellulare, la migrazione e il tamponamento del microambiente. L’espressione deregolata di CA9 è spesso studiata come marcatore di nicchie ipossiche e acidificate ed è collegata a un equilibrio redox alterato e a fenotipi associati all’invasione in modelli di patologie dei tessuti solidi. Queste proprietà rendono CA IX un nodo utile per indagare la segnalazione dipendente dal pH, i programmi trascrizionali responsivi all’ipossia e le pressioni selettive guidate dal microambiente.

CA IX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CA9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CA IX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CA9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CA9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CA IX. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CA9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CA IX nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CA IX nelle cellule tumorali con espressione di CA9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.