C9 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401198-ACT

Il C9 umano codifica il componente 9 del complemento, un effettore terminale della cascata del complemento che polimerizza all’interno del complesso di attacco alla membrana (MAC) per perforare le membrane bersaglio e promuovere un danno litico. La funzione di C9 si integra con la segnalazione dell’immunità innata attraverso l’attivazione delle vie classica, lectinica e alternativa, modulando infiammazione, opsonizzazione ed eliminazione dei patogeni. Un’attività deregolata della via terminale del complemento e la deposizione del MAC sono state implicate nel danno tissutale e nell’infiammazione cronica in diverse condizioni immuno-mediate e degenerative, supportando l’uso di C9 come nodo meccanicistico per lo studio della patologia guidata dal complemento. La modulazione sperimentale dell’espressione di C9 consente di indagare come l’attività terminale del complemento influenzi le risposte cellulari allo stress, l’integrità delle barriere e le interazioni tra cellule immunitarie e tessuti.

C9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di C9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus C9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione C9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus C9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C9 nelle cellule tumorali con espressione di C9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.