c-Fos Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420400-ACT

Il gene Fos del topo codifica il fattore di trascrizione immediate-early c-Fos, una componente del complesso AP-1 responsiva agli stimoli, che forma eterodimeri con proteine della famiglia JUN per regolare programmi genici che controllano proliferazione, differenziamento, adattamento allo stress e plasticità sinaptica. c-Fos viene indotto rapidamente a valle della segnalazione MAPK/ERK, di vie calcio-dipendenti e di cascate mediate da GPCR, collegando segnali extracellulari al rimodellamento della cromatina e della trascrizione. Essendo un marcatore ampiamente utilizzato dell’attività neuronale e degli stati di attivazione cellulare, l’espressione di Fos fornisce un indicatore dell’attivazione di specifiche vie di segnalazione in diversi tessuti. Un’attività AP-1 deregolata che coinvolge c-Fos è stata associata a alterazioni della segnalazione infiammatoria e a reti trascrizionali oncogeniche, a supporto della sua rilevanza in modelli di biologia tumorale e di regolazione immunitaria.

c-Fos Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Fos senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

c-Fos Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Fos nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Fos, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di c-Fos. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Fos nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da c-Fos nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via c-Fos nelle cellule tumorali con espressione di Fos silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.