BVES Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403698-ACT

BVES (blood vessel epicardial substance), noto anche come POPDC1, codifica una proteina associata alla membrana, arricchita nei tessuti cardiaci ed epiteliali, che funge da regolatore dell’adesione cellula–cellula e del traffico di membrana legandosi al cAMP. BVES partecipa all’organizzazione delle giunzioni e al rimodellamento del citoscheletro, influenzando l’integrità epiteliale, la migrazione e i fenotipi di conduzione elettrica nel muscolo striato. Attraverso la modulazione della segnalazione dipendente dal cAMP e delle relative interazioni con proteine scaffold, BVES contribuisce all’omeostasi tissutale e alle risposte allo stress. Alterazioni dell’espressione o della localizzazione di BVES sono state associate a difetti della funzione di barriera epiteliale e a fenotipi legati alla conduzione cardiaca, a supporto della sua rilevanza in studi meccanicistici di vie associate alla cardiomiopatia e alla disregolazione epiteliale.

BVES Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BVES senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BVES Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BVES nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BVES, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BVES. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BVES nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BVES nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BVES nelle cellule tumorali con espressione di BVES silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.