Borealin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403003-ACT

CDCA8 kodiert Borealin, eine essenzielle Untereinheit des Chromosomal Passenger Complex (CPC), die den mitotischen Ablauf koordiniert, indem sie die Chromosomenausrichtung, die Kinetochor‑Mikrotubuli‑Anheftung, die Signalgebung des Spindelkontrollpunkts und die Zytokinese reguliert. Durch funktionelle Kopplung an die Aurora‑B‑Kinase sowie INCENP/Survivin trägt Borealin dazu bei, die CPC‑Aktivität an Zentromeren und in der Zentralspindel (Midzone) zu positionieren, um eine korrekte Trennung der Schwesterchromatiden sicherzustellen. Eine Störung der CDCA8‑Expression beeinträchtigt die mitotische Genauigkeit, fördert Aneuploidie und ist häufig mit proliferativen Zuständen verbunden, wie sie in verschiedenen Krebsarten beobachtet werden. Daher wird CDCA8 umfassend in Signalwegen untersucht, die die Zellzykluskontrolle, chromosomale Instabilität und Stressantworten während der Zellteilung steuern.

Borealin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDCA8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Borealin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDCA8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDCA8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Borealin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDCA8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Borealin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Borealin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDCA8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.